当前位置： 甲型病毒性肝炎 > 疾病治疗 > 小GTPaseRab蛋白Rab5B调节
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前言
目前乙肝病毒（HBV）装配/释放途径的机制的细节仍不清楚。已知Rab蛋白是细胞囊泡运输中的分子开关，为了鉴定HBV产生的关键调控因子，研究者在HepG2.2.15细胞中使用小干扰RNA（siRNA）对Rab蛋白分别进行敲减。在62种Rab蛋白中，抑制Rab5B后培养上清液中的HBVDNA明显增加提示具有感染性的HBV颗粒可能增加。Northernblot实验结果进一步表明，编码大乙型肝炎表面蛋白（L-HBs）的2.4kbmRNA水平增加。对肝细胞核因子（HNFs）的分析表明，HNF4α的表达受Rab5B的负性转录调控，而HNF4α具有增强2.4kbmRNA转录的作用。另外，Rab5B敲减后可观察到L-HBs在内质网（ER）中的积累增加，但其在介导HBV包膜形成的多囊泡体（MVB）中则没有积累。因此，作者推测Rab5B是将L-HBs从ER转运到MVB的过程所必需的。免疫荧光显微镜检查显示，敲减Rab5B后细胞内可观察到HBs蛋白（包括L-HBs）与乙型肝炎病毒核心蛋白（HBc）在ER中的共定位。这一结果提示HBV包膜包装不仅在MVB中发生，也可发生在ER中。综上，Rab5B是HBV病毒颗粒产生的关键调节因素，可以作为抗病毒治疗的靶点。
病毒成分和病毒粒子的运输途径目前仍不明确。既往观点认为HBV包膜来自内质网（ER）膜，但最近的一些报道表明，获得包膜的过程利用了晚期内吞途径的一个隔室结构，即多囊泡体（MVB）。囊泡运输是一种系统，其中的内容物在不同的细胞区室之间运输。小GTPaseRab蛋白被称为分子开关，可调节内吞和分泌途径中小泡的形成、运输、束缚和融合。因此，推测这些蛋白质在HBV的生命周期中可能也起到了一定的作用。
筛选影响上清液中HBV释放量的Rab蛋白
该文作者使用siRNA分别敲低了HepG2.2.15细胞中的62种Rab蛋白，并在转染siRNA3天后评估了培养上清液中HBVDNA和HBsAg的变化。发现有几种siRNA能影响上清中HBVDNA或HBsAg的水平（图1A和B）。当在两个维度上绘制HBVDNA和HBsAg的变化时，一些siRNA同时升高或降低了上清HBVDNA和HBsAg，一些siRNA使HBVDNA升高同时降低了HBsAg，但未发现能同时降低上清中HBVDNA并增加HBsAg的siRNA（图1C）。在进行研究的siRNA中，Rab5BsiRNA显著增加了培养上清中的HBVDNA水平。
图1基于siRNA的Rab蛋白筛选结果，评估其对HBVDNA和HBsAg释放的影响。
接下来进一步研究了Rab5B及其同工型（Rab5A和Rab5C）对HBV复制的影响。Westernblot实验表明，分别靶向Rab5各个亚型的的siRNA敲减效率均可达75％以上，并且不会影响其他同工型（图2A）或其他Rab蛋白，如在内体运输中起作用的Rab7和Rab11（图2B）。同样，Rab5A、Rab5B和Rab5C敲低也不会改变内吞体分选转运复合体（ESCRT）蛋白Hrs、TSG和Vps4的表达水平（图2C）。在Rab5B敲低后HBVDNA的水平升高，直到siRNA转染5天后达到稳定（图2D）。因此，在后续实验中，作者分析了转染后5天的数据。在Rab5的3个同工型中，Rab5B对HBVDNA释放的抑制作用最强（敲减Rab5B后HBVDNA增加了30倍以上（图2E））。细胞内DNA的Southernblot显示，在Rab5B敲减的细胞中，与上清液中HBVDNA的结果一致，HBVDNA的复制中间体大量增加（图2F）。当去除背景信号后对HBVDNA的总信号水平进行定量时，与未经处理的对照siRNA（nontargetingcontrol,NT）相比，Rab5A、Rab5B和Rab5C敲减细胞中HBVDNA信号水平的增加倍数分别为11.3、26.4和13.6。而Rab5C对HBsAg释放的影响最高（图2G），表明不同Rab5同工型在HBV颗粒（包括Dane颗粒、裸衣壳颗粒和亚病毒颗粒（SVP））的释放中的作用不同。培养上清液经聚乙二醇（PEG）浓缩后Westernblot发现，敲减Rab5B和Rab5C后HBsAg增加是由于L-HBs增加（图2H）。Rab5A和Rab5B敲减后上清液中的HBeAg水平降低（图2I）。
图2HepG2.2.15细胞敲减Rab5B对HBV释放的影响。
使用靶向Rab5B其他位点的siRNA(#3和#2)（图3A和B）、在HepAD38细胞（图3C）、HBV感染的HepG2-NTCP-C4细胞（图3D）和HBV感染的人源化嵌合小鼠来源的原代人肝细胞（PXB细胞）（图3E）中都证实了Rab5B的敲低效应。当敲除Rab5B后，再过表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的Rab5B时，Rab5B的敲低效应被部分抵消（图3F和G）。
图3在多种条件下确认Rab5B的敲低效应。
Rab5B敲除后增加的HBV颗粒的分析
将细胞的上清液样品进行蔗糖密度梯度离心，并测定每层的HBVDNA水平，结果表明HBVDNA有2个峰（图4A至D）：一个峰密度较高（1.24至1.26g/mL），另一个峰密度较低（1.16至1.18g/mL）。分析来自nontargetingcontrol（NT）siRNA转染细胞的上清液时，HBVDNA的最高峰在较高密度层中（图4A）。相反，Rab5B敲低的细胞的上清液中HBVDNA的最高峰在较低密度层中（图4C）。用去垢剂NP-40处理破坏HBV包膜后，较低密度的峰转移至较高密度（图4B和D），表明较低密度层中的HBVDNA是有包膜的HBV颗粒，高密度层中的颗粒是裸衣壳。为了确定每个峰的颗粒特征，在用抗HBs或HBc抗体免疫沉淀后进行了qPCR，确证了低密度峰中的HBVDNA被HBs包被，而高密度峰中的HBVDNA没有被HBs包被且HBc是暴露的（图4E和F）。与对照细胞相比，使用敲减Rab5B的HepG2.2.15产生的HBV病毒颗粒感染HepG2-NTCP细胞发现，敲除组释放的HBV颗粒感染性更强（图4G）。这些数据表明，Rab5B敲低显著增加了Dane颗粒的释放。关于裸衣壳颗粒，当比较图4A（NTsiRNA）和图4C（Rab5BsiRNA）的高密度峰（11和12层）中的HBVDNA拷贝数时，后者更高（5.8×10?vs.7.9×10?），表明裸衣壳颗粒的释放也增加了。
图4Rab5B敲低后释放的HBV颗粒特征。
敲减Rab5B使细胞中L-HBs的水平升高
HepG2.2.15细胞敲减Rab5B后，L-HBs、M-HBs和S-HBs的水平增加（分别是NTsiRNA的2.3倍，1.7倍和2.4倍）（图5A）。在HepAD38细胞中也获得了相似的结果，并用抗preS1抗体确证了L-HBs的变化（图5B）。Northernblot显示Rab5B的敲减增加了2.4kb和2.1kbmRNA水平（图5C），这表明L-HBs蛋白水平的增加是由于2.4kbmRNA的转录增强引起的。在Rab5B敲减组与对照组细胞之间，3.5kbmRNA的水平没有显著性差异（图5D和E）。
图5敲减Rab5B对细胞中HBV蛋白和mRNA水平的影响。
核转录因子分析
既往报道显示2.4kbmRNA的转录受HNF4α控制，为了阐明2.4/2.1kbmRNA转录增强的机制，作者分析了敲减Rab5蛋白后细胞核中人类肝细胞核因子（HNFs）的活性。结果显示，HNF4α活性在Rab5B敲减后显著增加（图6A）。在Rab5B敲减的细胞中HNF4α的mRNA水平及蛋白水平均升高（图6B-C），用HepAD38细胞也获得了相同的结果（图6D）。由此可见，Rab5B敲低以某种方式增加了HNF4α的转录，从而导致L-HBs表达的增加。在Rab5B敲除后，再额外敲除HNF4α，上清液中HBVDNA增加的现象消失（图6E），表明Rab5B敲减效应至少部分由HNF4α所介导。通过免疫荧光显微镜观察HNF4α的表达，发现大多数细胞核中的HNF4α含量较低，但在Rab5B敲低后明显升高（图6F和G）。在Rab5B敲除的挽救实验中，GFP-Rab5B转染细胞的HNF4α处于低水平（图6F，箭头）。在图6F的细胞中随机选择40个NTsiRNA或siRab5B的细胞测定其HNF4α的信号水平结果与之前一致（图6G）。
图6Rab5B对HNF4α转录的调节。
敲减Rab5B后，L-HBs在ER中积累
免疫荧光实验显示，总的HBs（L+M+S）积累在Rab5B敲减细胞的核周，并与ER标记物钙联蛋白（calnexin）共定位（图7A），但与高尔基体标记物高尔基磷酸化蛋白2（GOLPH2）则没有共定位（数据未显示）。转染GFP-Rab5B可抵消Rab5B敲减后HBs的积累（图7B和C）。有趣的是，尽管在对照细胞中HBs与Rab7阳性MVB共定位，但在敲减Rab5B的细胞中HBs未与Rab7阳性MVB共定位（图7D）。同样，FLAG-LHBs与MVB标记物CD63在对照细胞中共定位，但在敲减Rab5B的细胞中未共定位（图7E），这表明Rab5B是L-HBs向MVB转运所必需的。FLAG-LHBs被GFP-Rab5B包围也支持该假设（图7F）。此外，使用Rab7（MVB标记物）和preS1抗体评估了HepAD38细胞中L-HBs和MVB的共定位情况（图7G和H），Rab5B敲低后观察到类似的变化。图7H为使用8个随机图像，通过像素的皮尔逊相关系数对Rab7和L-HBs的共定位进行量化的结果。
图7Rab5B敲减后，L-HBs在ER中积累，但在MVB中不积累。
作者用OptiPrep进行密度梯度离心后进一步进行了亚细胞结构分离，以鉴定L-HBs的定位。使用抗早期内体抗原1（EEA1）、肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（Hrs）、肿瘤易感性基因（TSG），钙联蛋白和GOLPH2分别作为早期内体（EE）、MVB、ER和高尔基膜的标记物。每层的蛋白质印迹分析表明，可以在几乎相同的层中检测到EE和MVB标记物（主要是3-11级），而在较重的层中主要检测到ER和高尔基体标记（主要是13-21级）（图8A至D）。与免疫荧光显微镜检查的结果一致，L-HBs在敲减Rab5B的HepG2.2.15细胞的ER/高尔基体中积累（图8E）。因为抗HBs抗体的印迹在对照HepG2细胞的MVB/内体层中显示出微弱的非特异性条带（图8F），所以用该抗体很难评估L-HBs在这些组分中的存在。此外，使用HepAD38细胞和抗preS1抗体进行的类似分析显示，在Rab5B敲减后，L-HBs在ER/高尔基体中积累（图8G）。
图8亚细胞分层显示Rab5B敲低后L-HBs在ER中积累。WCL：全细胞裂解液；PNS：去核上清液。
内质网中积累的L-HBs可用于包装核衣壳
共聚焦显微镜分析，在敲减Rab5B的HepG2.2.15细胞观察到HBs与HBc的共定位（图9A）。图9B显示了HBc和HBs仅在核周区域中共定位，这表明核衣壳的包装不仅发生在MVB中，而且在积累了L-HBs的ER中也有发生。因此，作者认为含有丰富的L-HBs的ER膜可用于HBV的包装。在转染NTsiRNA和Rab5BsiRNA的细胞中均观察到HBc和CD63的共定位。这表明即使MVB膜上很少或没有包膜蛋白，核衣壳也可以转运到MVB中。
图9Rab5B敲减细胞的ER中积累的L-HBs可能会包裹HBV颗粒。B图为在另一个敲减Rab5B的细胞中，对白色箭头上的HBc和HBs信号水平进行了定量。在核周区域观察到HBc和HBs的共定位情况。
为了评估内吞体分选转运复合体（ESCRT)是否参与上述过程，作者进一步分析了Rab5B和TSG或Vps4A双重敲除细胞释放的HBV相关颗粒的浮力密度（图10A至F）。转染靶向Vps4A的siRNA后，通过Westernblot检测到的总Vps4水平（Vps4A和Vps4B）下降到了对照的30％，作者据此推测在HepG2.2.15细胞的Vps4主要是Vps4A。Rab5B+TSG双敲除细胞主要释放裸衣壳颗粒（图10D），而Rab5B单敲除、及Rab5B+Vps4A双敲除细胞主要释放Dane颗粒（图10F）。该结果提示，至少一部分ESCRT机制（TSG而不是Vps4）对ER膜上HBV包膜的形成是必需的。
图10HepG2.2.15细胞敲减TSG或Vps4A后释放的HBV颗粒浮力密度的变化。
总结
在该研究中，基于siRNA的Rab蛋白筛选显示Rab5B在调节HBV产生中具有两个作用：抑制HNF4α转录和增强L-HBs的运输（图11A）。敲减Rab5B导致HNF4α转录及转录L-HBs的增加及L-HBs在ER中的积累，从而导致Dane颗粒释放增加（图11B）。
图11该模型描述了Rab5B在HBV生命周期后期的作用。
文献来源：
InoueJ,NinomiyaM,UmetsuT,etal.SmallInterferingRNAScreeningfortheSmallGTPaseRabProteinsIdentifiesRab5BasaMajorRegulatorofHepatitisBVirusProduction.JVirol.;93(15):e-19.PublishedJul17.doi:10./JVI.-19
编译：彭思雯
编辑：顾智强
校对：文夏杰邹军席婧媛
片警实验室
乙肝病毒病原学及相关研究
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