当前位置： 甲型病毒性肝炎 > 疾病病因 > 学术动态83丨戊型肝炎病毒与宿主细胞相
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摘要
戊型肝炎病毒（HepatitisEVirus，HEV）是全世界范围内人类急性病毒性肝炎的主要病原体，但我们对HEV感染引起疾病的肝脏病理学及其致病机制依然知之甚少。宿主细胞与病毒蛋白间的分子相互作用是在病毒生命周期中决定病毒宿主范围及其发病机制的重要因素。该综述主要总结了目前科学界对HEV与宿主细胞相互作用机制的了解，并介绍了开展相关研究的实验策略、技术，以及鉴定与HEV相互作用的新型宿主细胞因子的方法。了解HEV与宿主细胞间的相互作用，可以帮助我们更好地了解HEV的生命周期，并可能进一步发现新的治疗策略和抗病毒药物靶点。
全球范围内，每年约有万人感染戊型肝炎病毒（HepatitisEVirus，HEV），导致约万急性病例及-人死亡。在免疫能力正常的个体中，HEV感染通常呈急性、无症状、自限性的特点，但在免疫能力低下的患者及孕妇等危险人群中，HEV感染可慢性化或导致暴发性肝炎。同时，HEV感染还可引发多种肝外表现，如神经系统损伤、肾脏疾病和胰腺炎等。目前，HEV感染的治疗药物仅有广谱抗病毒药物利巴韦林（Ribavirin，RBV）及聚乙二醇干扰素-α（pegIFNα）。但由于患者可能发生不良反应，RBV的治疗常常会受到限制，且近期也有对RBV敏感性较低的毒株被分离。因此，亟需有效、安全的HEV治疗新策略。
HEV被归类于戊型肝炎病毒科。目前，已有8种不同基因型的HEV被发现，其中基因1、2、3、4和7型HEV均可感染人类。基因1型及基因2型HEV仅感染人类，主要存在于发展中国家，通过粪-口途径引起水源性暴发。而基因3型、4型及7型HEV则为人兽共患病原体，具有更广泛的宿主范围，常在发达国家中导致偶发的人兽共患戊型肝炎。
HEV的基因组包括3个开放阅读框（OpenReadingFrames，ORFs），ORF1编码非结构蛋白，包括甲基转移酶、木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶、解旋酶和RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRp）等；ORF2编码衣壳蛋白；ORF3编码在病毒颗粒组装和释放中起到重要作用的小型多功能蛋白质。近期研究表明，基因1型HEV还可表达另一个ORF4蛋白，如图1所示。HEV生命周期的许多方面及决定感染结局的病毒-宿主相互作用依然不甚清晰。近期对鼠HEV的研究显示，这种属于正戊肝病毒C属的病毒也可感染免疫健全的患者并引起严重的肝炎症状。这种具有人兽共患潜力HEV的发现更加强调了研发HEV新治疗策略的迫切性。
图1HEV基因组，及与HEV相关的宿主相互作用因素。HEV基因组能够编码3个开放阅读框（ORF）：非结构多聚蛋白ORF1（红色）、衣壳蛋白ORF2（绿色）和具有离子通道并与病毒释放相关的小型多功能蛋白ORF3（蓝色）。ORF1多聚蛋白包括七个功能域，包括甲基转移酶、Y结构域、木瓜蛋白酶样蛋白酶、高变区（HVR）、X结构域、解旋酶和RNA依赖性RNA聚合酶。与病毒蛋白/结构或RNA直接相互作用的宿主因素在框中得以表示，并在表1中列出。宿主RNA序列能够插入病毒的HVR区域、可能的宿主蛋白酶切割位点包括Xa因子（黑色三角形）和凝血酶（绿色三角形）。
一般而言，病毒依赖于宿主的核酸、蛋白质和能量代谢，以确保自身的复制和长期存在。病毒蛋白常可干扰宿主细胞的信号传导途径或过程及其抗病毒防御机制；而病毒与宿主因素之间的相互作用则决定了病毒感染的过程及结局。因此，病毒的宿主嗜性主要由两个方面决定：宿主细胞对该病毒易感（表达病毒进入所需的受体），并支持该种病毒的复制。也正是因此，研究HEV及宿主细胞在感染过程中发生的相互作用对理解戊型肝炎的发病机理、开发抗病毒疗法至关重要。特别地，靶向HEV生命周期中所需宿主因素的替代治疗策略可能极大地减少耐药（或对药物不敏感）HEV毒株的出现。尽管HEV病毒宿主广泛且有多种新的实验动物模型（如慢性HEV感染的猪模型），但我们仍未在动物中鉴定出特定的宿主易感因素。本文将综述HEV生命周期不同阶段中病毒因素与人宿主细胞因素间的相互作用。
HEV感染过程中宿主细胞因素与病毒因素间的相互作用
病毒的附着和进入
病毒附着及进入宿主细胞是病毒感染周期中的起始步骤，且与病毒的宿主范围、组织嗜性和发病机制密切相关。病毒可附着于细胞膜上的特定成分，因此细胞的膜成分也决定了病毒的细胞嗜性。HEV是一种准包膜病毒，在胆汁和粪便中以无包膜病毒的形式存在，而在血液中的HEV则具有一层宿主来源的膜结构。已有多个研究证实，两种HEV通过不同的机制进入细胞。参与裸露HEV附着及进入细胞的宿主因素总结于图2及表1。通过共免疫沉淀（coimmunoprecipitaiton，CoIP）及酶联免疫吸附实验（ELISA）方法，可证实位于基底外侧膜上的细胞表面受体脱唾液酸糖蛋白受体1/2（asialoglycoproteinreceptor1/2，ASGPR1/2）的胞外结构域可直接与病毒的衣壳蛋白（ORF2）相互作用。ASGPR的表达可增强HeLa细胞与HEV的结合，其耗竭可减弱PLC/PRF/5细胞与HEV的结合，但不影响其释放；抗ASGPR抗体和其胞外结构域的竞争性抑制剂也可抑制无包膜HEV与肝细胞的结合。这些研究证实ASGPR可能通过与ORF2结合，促进HEV的感染。对PLC/PRF/5细胞系亚克隆的微阵列分析表明，整合素3α（integrinα3，ITGA3）是一种潜在的附着/进入因子，可观察到其与无包膜HEV直接相互作用，但应用ITGA3的抗体并不能抑制细胞系对HEV的准入。其在无包膜HEV进入细胞过程中的作用仍需进一步分析。使用重组表达核衣壳蛋白ORF2生成的病毒样颗粒（virus-likeparticles，VLPs）作为无包膜HEV模型的研究显示硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparansulfateproteoglycans，HSPGs）、ATP合成酶5B（ATPsynthasesubunit5β，ATP5B）以及葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulatedprotein78，GRP78）均在病毒的附着和进入过程中起到一定作用。而有包膜HEV（envelopedHEV，eHEV）的膜表面则不存在病毒蛋白，意味着eHEV可能不依赖附着因子或细胞受体进入细胞。已有研究证实，eHEV总体上与宿主细胞的附着效率较低，且与HSPGs或ITGA3无关。eHEV膜上还有磷酯酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），其可能作为潜在的附着因子与细胞表面的T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域1（Tcellimmunoglobulinmucindomain1，TIM-1）结合，该机制已在包膜富含PS的多种包膜病毒中发现。HEV病毒体以两种形式存在，这种特性是否影响其在宿主体内的存活、传播和组织嗜性尚不清楚。鉴于HEV感染存在多种肝外表现，eHEV与细胞结合的较低特异性可能与HEV导致的肝外症状有关。总体而言，尽管多种宿主因子被发现与HEV的附着和进入相关，人们对不同宿主因素在感染过程中起到的确切作用仍知之甚少，且无包膜HEV进入细胞的受体依然未知。新的细胞培养体系、基因组筛选（结合cDNA、CRISPR和RNAi库）、深度测序和组学方法可推动对HEV受体的进一步研究。
表1目前已知的与HEV直接相互作用的宿主因素
HEV的内化和脱壳
穿过细胞膜是建立HEV感染的第一步。eHEV的准包膜可以逃避抗体介导的免疫反应，但病毒仍然需要内化并进行基因组的脱壳。有/无包膜HEV的内化均涉及网格蛋白（clathrin）和发动蛋白（dynamin）依赖性途径，但已有研究显示病毒基因组在不同时间点发生脱壳。Rab5和Rab7的敲低均不会改变无包膜HEV的感染性，但会导致eHEV的感染性降低。一般认为，eHEV脂质膜的降解需要其向溶酶体的运输。与此一致地，溶酶体中降解脂质膜所需的各种酶，如NPC细胞内胆固醇转运蛋白1（Niemann–PickC1protein，NPC1）或溶酶体酸性脂肪酶（lysosomalacidlipase，LAL），均可选择性地降低eHEV的感染性。这种机制也在准包膜的甲型肝炎病毒（HepatitisAVirus，HAV）感染过程中存在。从未感染细胞释放的非特异性细胞外囊泡则无法观察到其向溶酶体的运输，这一现象说明eHAV（及类似的eHEV）膜上可能存在特定的能使被包裹的病毒颗粒靶向至溶酶体的信号。定量蛋白质组学方法的研究可以给这一假设提供更多支持。尽管有/无包膜的HEV在细胞内释放的时间和空间不同，但尚不清楚这一过程是否以不同机制发生。但如果去膜后的eHEV的核衣壳与无包膜HEV的核衣壳类似，都可与同一蛋白发生相互作用，则晚期内体溶酶体和早期内体均需要存在一种潜在的受体，在两者间运输。可基于一种脱壳受体，研究新的治疗策略，以干预有包膜及无包膜HEV的复制。
HEV复制复合物
在病毒侵入宿主细胞的过程中，正链RNA病毒常诱导细胞内膜（如内质网、高尔基体、线粒体、内体和/或溶酶体）的重组以建立病毒复制位点。这些复制复合物能够起到支架作用，以增加病毒和细胞因子的局部浓度，提供受保护环境，并限制固有免疫系统对病毒蛋白和核酸的识别作用。HEV的复制所需蛋白主要由ORF1编码，包括甲基转移酶、RNA解旋酶和RdRp。在HEV复制过程中，仍不清楚多聚蛋白是否被加工为不同结构域，但在所有基因型HEV中都有保守的细胞凝血酶及Xa因子这两个潜在切割位点。丝氨酸蛋白酶抑制剂及靶向凝血酶和Xa的siRNA可抑制病毒复制。酵母双杂交体系筛选确定了种HEV与宿主蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用。研究显示，HEV与宿主间的蛋白相互作用可调控宿主细胞的应激和免疫反应、泛素-蛋白酶体系统、能量代谢、铁代谢和蛋白质翻译，且确定了HEV复制所需的一组宿主翻译因子（eIF4A，eIF3A和RACK1）。elF4A作为elF4F复合体的一部分，能够驱动真核细胞中依赖5’端帽结构的翻译起始，并参与各种RNA病毒的复制。天然化合物Silvestrol是一种elF4A的特异性抑制剂，可在体内及体外实验中抑制HEV的复制。通过亲和色谱及质谱方法，可鉴定与HEV基因组直接相互作用的其它宿主蛋白。体外分析显示，异质核糖核蛋白K（heterogeneousnuclearribonucleoproteinK，hnRNPK）和异质核糖核蛋白A2/B1（heterogeneousnuclearribonucleoproteinsA2/B1，hnRNPA2B1）可与病毒RNA中的启动子区域结合。这两种蛋白可参与新生pre-mRNA的包装，并通过募集细胞真核RNA代谢调节蛋白参与选择性转录剪接和翻译后修饰（post-translationalmodifications，PTMs）。因此，其与病毒RNA的结合可能表明HEV复制过程中存在结构的重排。细胞质点样结构（cytoplasmicdot-likestructures）中，可发现含病毒RNA及多功能ORF1蛋白的候选HEV复制复合物，但受制于直接研究病毒蛋白亚细胞定位工具的实用性问题，HEV复制复合物的组成、结构和构成时的时间、空间仍未被彻底研究。因此，可通过形态分析方法首先对感染细胞进行全方面的分析，如使用细胞涂片技术检测单个细胞的形态学特征，包括形状、质地、大小等，以识别细胞形态微小的变化。同时，可将较新的RNA近距离标记技术（如APEX-seq）应用于探测病毒蛋白空间微环境，以获得对HEV复制复合物组成的新见解。
病毒的组装和释放
病毒的组装过程常涉及病毒核衣壳与非结构蛋白之间的相互作用及宿主因素的协助。如图2所示，仅有小部分HEVORF2蛋白被用于组装感染性颗粒（ORF2i），大量具有潜在的免疫调节功能的ORF2则通过外泌体途径分泌。Montpellier等描述了两种被分泌的糖蛋白，即ORF2g及更小的切割形式ORF2c。这两种蛋白来自PTMs，且有其他研究显示有其它翻译调控方式可产生ORF2c、衣壳形式ORF2和分泌性ORF2s。这些研究成果的重叠性尚不清楚，且并未确定ORF2s的糖基化。使用VLPs的研究已提供了部分关于HEV基因组组装为病毒颗粒机制的见解，但关于HEV颗粒组装的许多基本问题仍然悬而未决，病毒组装的亚细胞定位、宿主因素的参与及组装的时间/空间协调仍然未知。近期，有研究使用完善的成像系统使丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus，HCV）的动力学和亚细胞结构可视化，并制作了HCV协调病毒复制及病毒颗粒组装步骤的拓扑图。同样地，共聚焦显微镜、电子显微镜及标记的HEV基因组可提供研究ORF2亚细胞定位和潜在病毒装配位点的可能方法。通过蛋白质组学和遗传学方法，可进一步确定病毒组装过程中涉及的宿主因素，这可能是新的药物靶点。病毒颗粒组装后，子代病毒颗粒即被释放并引发新一轮感染，该过程依赖于ORF3编码的多功能磷蛋白。未知的宿主激酶可使ORF3磷酸化，并促进其与ORF2相互作用。这可能是ORF3识别病毒并释放的机制。此外，已有研究显示ORF3可与细胞内运输机制的不同部分产生相互作用，如微管和TSG（内体分选复合物的组成部分），从而将病毒载入多囊体（multivesicularbodies，MVBs）并释放。ORF3的这种作用同时依赖于其磷酸化和棕榈酰化。因此，两种宿主蛋白均可成为干扰HEV生命周期的靶点。肝细胞内，MVBs的极化运输和分泌可导致eHEV颗粒从基底外侧膜释放并扩散至宿主体内，也可从顶侧膜释放进入胆汁并被高浓度的胆汁酸和胆汁酸盐转化为无包膜HEV。HEV准入的新极化细胞模型或可作为进一步研究HEV释放机制的重要工具。
图2HEV复制周期及其与宿主因素相互作用示意图。HEV以有包膜（eHEV）和无包膜两种形式存在，无包膜病毒颗粒附着于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparansulfateproteoglycans，HSPG），去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoproteinreceptor，ASGPR）和整联蛋白α3（integrinalpha3，ITGA3）；有包膜HEV则通过含磷酯酰丝氨酸的膜与宿主细胞表面的T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域1（Tcellimmunoglobulinmucindomain1，TIM-1）相互作用，附着于宿主细胞。有/无包膜的病毒颗粒均需要网格蛋白和发动蛋白依赖性机制内吞。HEV脱壳的相关机制仍不明确，但已确定的是两种形式的HEV需要不同机制进行脱壳。无包膜HEV颗粒在早期内体中进行脱壳，RNA基因组一般被认为通过病毒体及受体结合时形成的孔结构释放至细胞质。而eHEV需要通过Rab5阳性及Rab7阳性的晚期内体和溶酶体进行运输及脱壳。HEV的脱壳过程需要溶酶体的酸化、NPC细胞内胆固醇转运蛋白1（Niemann–PickC1protein，NPC1）和溶酶体酸性脂肪酶（lysosomalacidlipase，LAL），表明该过程需要降解病毒的脂质膜。正义RNA基因组首先被翻译为ORF1多聚蛋白，随后在RdRp的作用下产生一个负义链RNA，作为基因组和亚基因组RNA转录的模板，编码ORF2和ORF3蛋白。目前认为ORF2有几种不同的形态，其大小和糖基化状态不同，通过一种未知蛋白酶的水解切割作用（ORF2c）或替代翻译作用（ORF2s）形成较小的ORF2蛋白。此外，这两种形式的ORF2都可被未知的酶糖基化（ORF2g）。这三种修饰后的ORF2均可分泌至血液中，作为免疫诱饵。未经修饰的传染性ORF2（ORF2i，即ORF2衣壳蛋白）可自组装并形成病毒衣壳。ORF3可被未知的激酶磷酸化，使其与未修饰ORF2结合并促进病毒颗粒的释放。磷酸化的ORF3还可与肿瘤易感基因（tumorsusceptibilitygene，TSG）结合，参与内体分选复合物（endosomalsorting
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