酶联免疫吸附试验ELISA种类和应用

酶联免疫吸附测定(ELISA)被称为免疫测定金标准。是一种免疫学测定方法，这种测试一般较为灵敏，通常用于检测和量化物质，包括抗体、抗原、蛋白质、糖蛋白和激素。酶联免疫吸附试验也常用于诊断HIV感染、妊娠试验和血型鉴定等。

碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶是ELISA中很少使用的酶。

ELISA在原理上类似于放射免疫测定(RIA)，但更安全且成本较低。

ELISA有助于抗原或抗体的定性（存在或不存在）和定量（浓度）测量。

当前使用的酶联免疫分析技术主要有以下几种：

1.直接ELISA

直接和间接ELISA都从将抗原包被到ELISA板上开始。

步骤：

·将抗原添加到板中，在7摄氏度下孵育一小时或在4摄氏度下孵育过夜。

·孵育步骤完成后，下一步是清洗任何潜在未结合抗体的板，并使用BSA、卵清蛋白、抑肽酶或其他动物蛋白等试剂封闭ELISA板上任何未结合的位点。

·这一步很重要，因为它可以防止任何非特异性抗体与板结合，并尽可能地减少假阳性结果。添加缓冲液后，重新洗涤板，并添加选定的酶联检测一抗。将板进一步温育一小时。

·在直接ELISA中，主要检测抗体直接与感兴趣的蛋白质结合。

·接下来，重新洗涤板以去除任何未结合的抗体，然后向板中添加底物/发色团，例如碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)，从而导致颜色变化。样品的颜色变化是通过AP从底物中水解磷酸基团或通过HRP氧化底物而发生的。

使用直接ELISA的优势主要是消除二抗交叉反应，并且由于步骤更少，与间接ELISA相比速度更快。它的缺点包括与其他类型的ELISA相比灵敏度低，反应成本高。

2.间接ELISA

间接ELISA的步骤与直接ELISA相同，除了额外的洗涤步骤和去除缓冲液后添加的抗体类型。间接ELISA需要两种抗体，一种是粘附在目的蛋白上的检测一抗，另一种是与一抗互补的酶联二抗。

开始需要加入一抗，然后进行洗涤步骤，再加入酶联二抗并孵育。此后，步骤与直接ELISA相同，包括洗涤步骤、添加底物和检测颜色变化。

简要步骤如下：

·将含有一抗(Ab1)的样品添加到抗原包被的微量滴定孔中，然后附着在孔中的抗原与Ab1发生反应。

·未结合或游离的Ab1都被洗掉，酶标二级抗体(Ab2)被添加到微量滴定孔中。

·与酶偶联的二抗与一抗结合。

·游离或未结合的Ab2都被洗掉，并添加酶的特定底物。

·形成的有色反应产物的量的测定主要由紫外分光光度计、酶标仪、微孔板读板机等仪器来完成。

间接ELISA法也常用于检测血清中是否存在抗HIV抗体。与直接ELISA相比，间接ELISA具有较高的灵敏度，反应成本较低，这种类型的ELISA的主要缺点是二级检测抗体之间存在交叉反应的风险。

.酶联免疫吸附试验-夹心式elisa

与直接和间接ELISA不同，夹心ELISA从包被到板孔上的捕获抗体开始。因为抗原夹在两层抗体（捕获抗体和检测抗体）之间，所以也称为“三明治”。

流程如下：将捕获抗体添加到板中后，将板盖上并在4°C下孵育过夜。包被步骤完成后，用PBS清洗板，然后用BSA缓冲/封闭。缓冲液洗涤在室温下进行至少1-2小时。末了，在加入抗原之前用PBS再次洗涤板。

然后将目标抗原添加到板中以与捕获抗体结合并在7摄氏度下孵育90分钟。重新清洗板，然后将检测一抗添加到板中并再孵育1至2小时在室温下，然后用缓冲液清洗。然后加入酶联二抗，再孵育1至2小时。重新清洗板，加入底物以产生颜色变化。夹心ELISA在所有ELISA类型中具有具有较高的灵敏度。夹心式elisa的主要缺点是会耗费较多的时间和费用，另外这种ELISA方法，必须要使用配对的抗原（二价/多价抗原）和二抗。

简略步骤如下：

·使用夹心式elisa，抗体被固定在微量滴定孔中，而不是抗原。

·添加含有待检测或测量的抗原的样品并使其与固定化抗体反应。

·清洗孔并加入对抗原上不同表位具有特异性的第二种酶联抗体，并使其与结合的抗原反应。

·通过洗涤去除任何游离的二抗后，加入酶特异性底物。

·这称为夹心ELISA，因为待检测的抗原夹在两种抗体（结合抗体和酶联抗体）之间。

·末了，通过分光光度计、酶标仪等实验室仪器使用分光光度法来测定有色反应产物。

4.酶联免疫吸附试验-竞争性ELISA

竞争性ELISA方法主要用于检测血清中是否具有特异性的抗原/抗体。这种类型的ELISA会使用两种特异性抗体，一种酶联抗体和另一种存在于测试血清中的抗体（如果血清呈阳性）。将两种抗体结合到孔中将允许竞争结合抗原。颜色变化的存在意味着测试是阴性的，因为酶结合抗体结合了抗原（而不是测试血清的抗体）。没有颜色表明测试呈阳性，并且测试血清中存在抗体。

该技术中，需要将抗体与溶液形式的抗原（在样品中）一起孵育，然后将该混合物添加到抗原包被的微量滴定孔中。样品中存在的抗原越多，可用于结合抗原包被孔的游离抗体就越少。添加对一抗同种型具有特异性的酶偶联二抗(Ab2)，用于确定与孔结合的一抗数量，如在间接ELISA中一样。

竞争性ELISA特异性低，不能用于稀释样品。然而，好处是需要的样品纯化较少，它可以测量给定样品中的大范围抗原，可用于小抗原。然而，需要注意的是在该技术中，原始样品中抗原的浓度越高，吸光度越低。

酶联免疫吸附试验ELISA的应用：

1.检测和测量给定样品中的抗原或抗体。（自身抗体：抗dsDNA、抗dsg1、ANA等；传染病抗体：抗菌、抗病毒、抗真菌；甲型、乙型、丙型肝炎、艾滋病毒等）

2.检测和估计肿瘤标志物的水平：比如：前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)

·检测食品样品中的潜在过敏原。

·用于某些类别药物的快速推定筛选。

·肽、抗体、激素、蛋白质等物质的检测和定量

·外泌体检测、细胞外囊泡检测等

影响酶联免疫吸附试验ELISA结果的因素有哪些？

主要包括检测板、包被缓冲液、捕获抗体、封闭缓冲液、靶抗原、检测抗体、酶偶联物、洗涤液、底物、信号检测的质量和完整性都会干扰正确的ELISA测试。一些可能干扰测试的因素如下：

1.微孔板：孔的形状和质量、板的材料、潜在的预激活、均匀或不均匀的涂层

2.缓冲液：pH、污染

.捕获和检测抗体：孵育时间、温度、特异性、滴度、亲和力

4.封闭缓冲液：交叉反应、浓度、污染

5.靶抗原：构象、稳定性、表位

6.酶结合物：类型、浓度、功能、交叉反应

7.清洗：污染、频率、体积、持续时间、成分

8.基板：微孔板的质量、材质

9.检测：检测相关的仪器设备：比如：分光光度计、读板机等相关因素

10.误差：人为误差（实验步骤不规范等）

荧光显微镜、纳米粒度分析仪、紫外分光光度计、酶标仪、读板仪等实验室仪器广泛用酶联免疫吸附试验、抗原检测、外泌体研究。#酶联免疫酶标仪#

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