当前位置： 甲型病毒性肝炎 > 疾病治疗 > 血清N糖组诊断模型在丙型肝炎患者肝
当前位置： 甲型病毒性肝炎 > 疾病治疗 > 血清N糖组诊断模型在丙型肝炎患者肝
来源：中华肝脏病杂志
作者：曹曦、张莹、南月敏等
摘要
目的
研究丙型肝炎不同分期肝纤维化患者血清中N-聚糖丰度变化，依此建立丙型肝炎肝纤维化诊断N-糖组模型并评估其临床应用价值。
方法
纳入例丙型肝炎肝纤维化患者资料，采用基于DNA测序仪的荧光标记糖电泳技术，检测和分析患者血清中9种N-聚糖。基于肝纤维化各期N-聚糖相对含量变化，应用二元logistics回归方法建立诊断模型，采用受试者操作特征曲线等评价其诊断效力，并与其他肝纤维化诊断模型比较。
结果
N-糖组诊断模型（模型B和模型C）在区分纤维化S1～S2与S3～S4和S1～S3与S4受试者操作特征曲线下面积最大（受试者操作特征曲线下面积=0.，0.），高于GlycoFibroTest（受试者操作特征曲线下面积=0.,0.）、GlycoCirrhoTest（受试者操作特征曲线下面积=0.，0.）、天冬氨酸转氨酶与血小板的比值指数（受试者操作特征曲线下面积=0.，0.）、肝纤维化4项指数（受试者操作特征曲线下面积=0.，0.）和S指数（受试者操作特征曲线下面积=0.,0.），但模型A（受试者操作特征曲线下面积=0.）在区分纤维化S1与S2～S4时诊断效力仅低于天冬氨酸转氨酶与血小板的比值指数（受试者操作特征曲线下面积=0.）。当N-糖组模型与天冬氨酸转氨酶与血小板的比值指数联合诊断各期肝纤维化时，受试者操作特征曲线下面积（模型A、模型B和模型C）为0.、0.和0.，提高了诊断效力。
结论
血清N-糖组模型诊断丙型肝炎肝纤维化具有潜在临床应用价值。
正文
丙型肝炎病毒感染是一个世界性的公共卫生问题，年全世界约有万人慢性感染丙型肝炎病毒[1]。慢性丙型肝炎持续发展可导致肝纤维化、肝硬化甚至肝癌，而肝纤维化是肝硬化与肝细胞癌发生的必经阶段。因此，早期肝纤维化诊断与治疗可以有效阻断或逆转肝病进展，减少终末期肝病发生。目前临床上以肝活组织病理学评价作为诊断肝纤维化的金标准，但肝活组织检查是一种有创检查，且可能存在取样误差，对同一名患者不宜反复应用。肝纤维化血清学标志物主要包括透明质酸、层黏蛋白和Ⅳ型胶原等，但其区分肝纤维化不同分期作用不明显。相关研究结果显示，随着丙型肝炎肝纤维化进展，患者血清中二天线无半乳糖基核心α-l，6岩藻糖基化平分型N聚糖含量上升，三天线N聚糖含量下降[2]，且慢性肝病进展至肝硬化时，二天线平分型核心α-l，6岩藻糖基化N聚糖含量上升[3]。由此看来，伴随肝纤维化病变进展，血清中不同种类N-聚糖含量也相应发生变化。本研究以未治疗丙型肝炎肝纤维化患者为研究对象，采用基于DNA测序仪的荧光标记糖电泳技术对患者血清N-聚糖图谱进行分析，探寻与肝纤维化发生和发展密切相关N-聚糖，依此建立肝纤维化N-聚糖诊断模型并评估其诊断效力。
资料与方法
1.研究病例：
选取来自医院与中国人医院慢性丙型肝炎患者资料，另选取健康志愿者资料作为对照组。研究组患者纳入标准：（1）符合丙型肝炎诊断标准；（2）患者做过肝穿刺活组织检查，有病理学诊断结果；（3）排除甲型、乙型、丁型、戊型等肝炎病毒感染；（4）排除酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎、梗阻性黄疸及其他原因引起的慢性肝病。
2.血清N-聚糖分析方法：
（1）寡糖的释放：取3μl血清中加入含有2μl10mmol/LNH?HCO?缓冲液和3μl去离子水的PCR反应板中，95℃加热5min后4℃放置,然后加入3μlPNGaseF（2.2U/μl），37℃孵育3h，4℃水浴后加入μl去离子水终止反应,标记为D板。（2）标记寡糖：从D板吸取10μl溶液加入1个新的PCR反应板中，开盖在60℃环境下烘干90min（可延长时间直至完全干燥），加入3μl标记溶液（APTS20mmol/L∶NaCNBH?1mol/L=1∶1），90℃反应2h，加入μl去离子水终止反应，标记为L板。（3）去唾液酸：从L板中取2μl溶液加入1个新的PCR反应板,加入0.2μl唾液酸酶,震荡混匀后42℃孵育4h,加40μl去离子水终止反应,标记为DE板。（4）DNA测序仪上机检测：取DE板10μl溶液用ABI测序仪进行N-聚糖图谱分析,数据经GeneMapper软件分析。经上述分析过程后,每份血清标本均可测得包含至少9个峰（9个N-聚糖）的糖组图谱,用单峰峰高除以9个峰峰高的和，得到量化峰值，采用量化后的峰值数据作为N-聚糖的相对含量。
3.统计学方法：
应用SPSS20.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（xbar±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析。用二元logistics回归的方法建立多个N-聚糖诊断模型。以肝活组织检查病理诊断结果为金标准，用受试者操作特征曲线评价诊断模型的诊断效力。在约登指数最大时选取最佳cut-off值，计算灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。所有的统计学分析均采用双侧检验，P0.05为差异有统计学意义。
结果
1.丙型肝炎肝纤维化患者血清N-聚糖图谱分析和N-聚糖诊断模型建立：
共收集例慢性丙型肝炎患者资料作为研究组，另选取30例健康志愿者资料作为对照组，患者临床资料见表1。丙型肝炎肝纤维化和健康人的血清N-糖组图谱见图1。每个标本均可测到9个N-聚糖峰，每个峰所代表的N-聚糖结构在之前的研究中已报道[4]（图1）。不同肝纤维化分期患者9个N-聚糖丰度变化和比较见表2、表3。
随着肝纤维化进展，N-聚糖峰2、3、7、9丰度明显升高，峰5、8则明显下降（表2），其中N-聚糖峰2、3、5、8的丰度在S1比S2～S4，S1～S2比S3～S4和S1～S3比S4组间比较差异均有统计学意义（P值均＜0.05）（表3），而N-聚糖峰7和9在S1～S2比S3～S4和S1～S3比S4组间比较差异均有统计学意义（P值均＜0.05）（表3）。应用二元logistics回归方法建立3个N聚糖多指标诊断模型，模型A=0.×peak2-0.×peak3-0.×peak5-0.×peak8+10.，区分肝纤维化S1比S2～S4；模型B=0.×peak2-0.×peak3-0.×peak5-0.×peak8+7.，区分肝纤维化S1～S2比S3～S4；模型C=0.×peak2+0.×peak7-0.×peak8+0.×peak9-2.，区分肝纤维化S1～S3比S4，并进行诊断效力评估。其中模型A和模型B将峰2、3、5、8纳入模型，分别区分肝纤维化分期S1比S2～S4和S1～S2比S3～S4。既往研究结果显示，在肝硬化患者血清中N-聚糖峰7和9丰度显著上升。本研究结果显示N-聚糖峰7和9在肝硬化患者（S4期）血清中含量明显上升，因此，我们将峰7与峰9纳入模型建立模型C来区分肝纤维化S1～S3期与S4期。
模型A，模型B和模型C在区分肝纤维化分期S1比S2～S4，S1～S2比S3～S4和S1～S3比S4的受试者操作特征曲线下面积值分别为0.，0.，0.（表4），在约登指数最大时确定cut-off值，诊断各纤维化分期的特异度分别为0.、0.、0.；灵敏度分别为0.、0.、0.，总体诊断效力较好，但灵敏度偏低。GlycoFibroTest：Log（peak2/peak8）与GlycoCirrhoTestLog（peak7/peak8）是基于丙型肝炎肝纤维化患者血清中两个N-聚糖变化建立的诊断模型[2-3]，将这两种模型纳入分析，与N聚糖多指标诊断模型受试者工作特征曲线下面积值进行比较，可见多指标模型诊断效力高于2个N-聚糖指标模型，见图2。
2.血清N-聚糖肝纤维化诊断模型与其他诊断模型比较及联合诊断：
目前临床上应用广泛的血清学肝纤维化诊断模型包括：天冬氨酸转氨酶与血小板的比值指数（APRI），肝纤维化4项指数（FIB-4）和S指数[5-7]。这些模型需要的参数为临床常规的血清学检查项目，检测方便，适用性强，我们将N-聚糖多指标诊断模型与这3种模型进行比较（表5）。N-聚糖多指标诊断模型B和模型C在区分肝纤维化分期S1～S2比S3～S4与S1～S3比S4时，诊断效力好于血清学指标APRI、FIB-4和S指数，而在区分肝纤维化分期S1比S2～S4时，APRI（受试者操作特征曲线下面积=0.）诊断效力高于其他单一模型。我们将3个N-聚糖多指标诊断模型（模型A、B、C）与血清学肝纤维化诊断模型（APRI、FIB-4、S指数）联合诊断肝纤维化。联合诊断效力较单一模型有不同程度提升，见表5。其中N-聚糖多指标诊断模型（模型A、B、C）与APRI联合诊断在区分肝纤维化分期S1比S2～S4，S1～S2比S3～S4与S1～S3比S4时，诊断效力最佳（受试者操作特征曲线下面积=0.，0.，0.）。综合来看，N-聚糖多指标诊断模型在区分肝纤维化不同分期方面，有着良好的诊断效力。
讨论
肝纤维化主要是指肝细胞受炎症等因素刺激时，肝脏中细胞外基质生成与降解失去平衡，导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的病理过程，是慢性丙型肝炎发展至肝硬化、肝癌的必经过程[8]。随着对肝纤维化研究的不断加深，人们发现肝纤维化是一个动态过程，具有一定可逆性。因此，早期诊断肝纤维化和早期干预、治疗，对阻断慢性肝病进展、提高治疗效果具有重要临床意义；肝硬化是肝癌发生最重要的危险因素，早期发现并及时治疗，可减少肝癌发生，显著提高患者生存率。目前研究者发现，单一血清学指标仅能部分反映肝脏某方面的变化，并不能全面有效评估肝纤维化的病变程度，多指标联合检测进行肝纤维化病变程度评估已成为提高诊断效力的常用方法。
糖基化是蛋白质最为常见的翻译后修饰形式，且特定病理状态下，往往蛋白质种类与数量无明显变化，但蛋白质糖基化存在较大差异。糖基化修饰是蛋白质发挥不同功能的关键，对蛋白质折叠、转运和生物活性方面有着重要影响。其中N-糖基化与O-糖基化是最常见的蛋白质糖基化修饰，人体内的N-糖链种类和数量要多于O-糖链，更适合作为血清学标志物[9]。以往研究基于丙型肝炎患者血清N-聚糖图谱变化，建立GlycoFibroTest模型与GlycoCirrhoTest模型诊断肝纤维化和肝硬化[2-3]，与传统血清学标志物相比，具有一定优势。这表明丙型肝炎肝纤维化患者血清异常N-聚糖水平变化和不同程度肝纤维化之间存在密切关系。
本研究结果显示，肝纤维化患者血清几种N-聚糖水平变化与纤维化病程进展密切相关，随着慢性丙型肝炎患者肝纤维化进展，N-聚糖峰2、3、7、9丰度明显升高，峰5、8则明显下降。人体内血清中N-糖蛋白主要由肝脏和B淋巴细胞合成，B淋巴细胞合成抗体免疫球蛋白G上N-聚糖，主要为核心岩藻糖基化二天线糖链结构，其中包括N-聚糖峰2、3和7。这3个N-聚糖丰度升高可能与丙型肝炎病毒感染及免疫应答相关，具体机制尚不清楚。三天线N-聚糖结构如峰8和峰9主要由肝脏合成，一定程度上反映肝脏的病理变化。N-聚糖的前体一般在肝细胞的内质网和高尔基体合成，糖基转移酶在合成过程中起主要作用。在肝纤维化发生过程中，三天线N-聚糖结构和丰度改变可能与肝纤维化引起肝细胞糖基转移酶（乙酰葡糖胺转移酶家族）表达水平变化密切相关[10-11]。本研究结果显示，肝纤维化S3期进展至肝硬化S4期时，三天线N-聚糖峰8丰度下降程度最大，峰9上升程度最大，可作为肝硬化发生的监测指标。
本研究根据慢性丙型肝炎肝纤维化患者血清中N-聚糖变化，建立3个诊断肝纤维化模型（模型A，模型B和模型C），分析其诊断效力，并与其他肝纤维化模型进行比较。结果表明，相对于应用两种N-聚糖的GlycoFibroTest模型与GlycoCirrhoTest模型，多指标N-聚糖诊断模型的诊断效力更理想；与APRI、FIB-4和S指数模型比较后，发现模型B和模型C诊断效力高于3个血清学指标模型。其中模型C在区分肝纤维化与肝硬化方面效力较好（受试者操作特征曲线下面积=0.）。相比之下，模型A在区分早期肝纤维化与中晚期肝纤维化方面效力（受试者操作特征曲线下面积=0.）低于APRI（受试者操作特征曲线下面积=0.）。而后我们将模型A，模型B和模型C分别联合APRI或FIB-4或S指数模型联合诊断，发现两种模型联合诊断效力要高于单一模型，APRI与多指标N-聚糖诊断模型联合诊断效力最理想，受试者工作特征曲线下面积均在0.8以上，尤其在区分早期纤维化上，多指标N-聚糖模型与APRI联合的诊断效力提升最为显著。本研究结果表明，将多种N-聚糖纳入诊断模型，与APRI联合诊断可以更全面准确反映肝脏病理变化，提高肝纤维化诊断效力。
瞬时弹性成像作为一种无创快速的检测肝纤维化的方法，在丙型肝炎肝纤维化诊断中具有良好的诊断价值，尤其用于各种重度肝纤维化的诊断[12-13]。Nudo等[12]采用瞬时弹性成像技术对慢性丙型肝炎患者进行肝脏硬度测定分析，结果表明，应用瞬时弹性成像诊断肝纤维化（≥F2与≥F3）和肝硬化（F4）的受试者操作特征曲线下面积分别为0.8，0.85和0.86。本研究结果显示，多指标N-聚糖与APRI联合诊断（受试者操作特征曲线下面积=0.）在区分早期纤维化（≥F2）时，诊断效力优于瞬时弹性成像技术，但在区分中晚期肝纤维化时，效力略低于瞬时弹性成像。瞬时弹性成像技术尽管可作为肝纤维化的无创性检查方法之一，但其准确性受患者肥胖程度、炎症等因素影响[14]，而且目前在我国拥有瞬医院比较有限。血清学指标检测，相对较易操作，医院作为常规检测项目实施。
参考文献
[1]中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.丙型肝炎
防治指南(2年版)[J].中华肝脏病杂志,2,12(2):-.
DOI:10.3/can.j.issn.7-7.2.12..
ChineseSocietyofHepatologyandChineseSocietyofInfectious
Diseases,ChineseMedicalAssociation.Guidelinesfortheprevention
andtreatmentofhepatitisC(2version)[J].ChinJHepatol,2,
12(2):-.DOI:10.3/can.j.issn.7-7.2.12..
[2]VanderschaegheD,LaroyW,SablonE,etal.GlycoFibroTestis
ahighlyperformantliverfibrosisbiomarkerderivedfromDNA
sequencer-basedserumproteingly
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