当前位置： 甲型病毒性肝炎 > 疾病用药 > 乙型肝炎病毒基因组进化及其对临床的影响
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摘要
乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球重大公共卫生问题，约有2.57亿人慢性感染，每年造成超过88万人死亡。HBV有9种不同的基因型，它们在疾病进展、自然史和治疗预后方面有所不同。虽然预防性乙肝疫苗的普遍接种使得新发感染大为减少，但是由于cccDNA的持续存在，慢性乙型肝炎（CHB）仍缺乏彻底治愈的手段。HBV是一种古老的病毒，最新的研究大大扩展了其宿主范围（包括鱼类和爬行动物），并为这一病毒家族的起源和进化提供了新的线索。这篇综述总结了目前关于HBV多样性对疾病进展和治疗应答以及正在开发的新型HBV疗法的潜在影响，还讨论了个体和群体水平上HBV多样性的可能机制。
HBV具有易慢性化、无症状期长、可缓慢进展为其他临床疾病等所有古老人类病原体的特征，这些特征使其能够在新石器时代以前的小种群中持续存在。年，人们从年前来自欧亚大陆的人类遗骸中鉴定出了HBV基因组，HBV作为人类病原体的“考古”时代也随之延长，而这些从古代遗骸中分离出的HBV与现代HBV序列几乎是难以分辨的，这表明病毒多样性在长时间内几乎没有发生变化。
HBV多样性的演变
宿主多样性
HBV是嗜肝病毒科（Hepadnaviridae）的一员。嗜肝病毒科由感染某些灵长类、啮齿动物和蝙蝠的正肝病毒属（Orthohepadnavirus）和感染某些鸟类的禽肝病毒属（Avihepadnavirus）组成。鱼类、爬行动物和两栖动物中也曾分离出嗜肝病毒科成员，它们虽然尚未被明确分类，却为嗜肝病毒的起源和进化提供了新的线索，并进一步加强了嗜肝病毒与其宿主物种共同进化的理论。除此之外，也有一些有趣的亚种，它们并不根据宿主物种聚类，比如感染尾皮蝠和白吸盘鱼的类嗜肝病毒（图1）。近年来，全基因组测序的普及使得嗜肝病毒的宿主谱不断扩大，有一项研究甚至在昆虫基因组中鉴定出了编码逆转录酶和RNaseH酶的保守结构域，该区域被证明与嗜肝病毒的亲缘关系最为密切。
图1嗜肝病毒系统发育树
对某些鸟类和爬行动物的内源性嗜肝病毒（整合到宿主中）的鉴定表明，嗜肝病毒的真实起源时间可能要比根据现代嗜肝病毒系统发育分析得出的起源时间早的多（2亿年前），比较系统发育分析也支持嗜肝病毒与宿主物种高水平共生。
最新的进化模型表明，嗜肝病毒可能起源于宿主基因组的逆转录因子，它最初可能只包含一个聚合酶基因，随后发展或获得了衣壳基因（图2）。其进化的下一个阶段，病毒包膜基因出现在一个与聚合酶基因重叠的阅读框中，病毒也因此表现出嗜肝性。仅在哺乳动物嗜肝病毒中出现的X基因可能是截至目前嗜肝病毒科进化的最终阶段。
从一系列非灵长类物种中检测到嗜肝病毒支持了病毒可在人畜间传播的可能性。有报道称从一种蝙蝠中分离出的病毒能够感染人的肝细胞，且不能被人anti-HBs抗体中和。HBVJ基因型与长臂猿HBV序列相似度达到90.1%，是HBV可从灵长类向人类传播的潜在证据。然而除此之外，嗜肝病毒从灵长类动物到人类跨物种传播的实证仍然不足。
图2嗜肝病毒基因组的进化模型
古代DNA中的人源HBV
对来自古代人类遗骸的病毒序列分析显示，一些分离物序列与非洲非人灵长类中发现的HBV关系最为密切（核苷酸序列相似度为92.5-94.0%），一些分离物与现代人HBVA、D基因型最为相似（核苷酸序列相似度为92.5-97.3%和97.0-98.7%），而来自蒙古的样本中含有与现代人HBVB基因型最相似的序列（核苷酸序列相似度为97.7%）。重组分析表明，一个D基因型相关的古老HBV序列可能是现代A基因型的祖先，因为这些远古HBV序列在HBsAg区含有现代HBV序列中的“a”决定簇氨基酸。这些古老的HBV序列在回答嗜肝病毒起源和进化问题的同时，也提出了更多的问题：远古灵长类动物中的HBV序列是否表明非人灵长类HBV是由人类传播给其他灵长类动物的，或者与此相反？
HBV进化
通过不同时期样本定义HBV进化率的早期研究显示，HBV序列有很高的替代率，该证据表明它的起源时间可能并不长（-年前）。然而，进一步使用外部校准点的分析结果表明，HBV的长期进化速度要慢得多，它很可能是一种更古老的病毒（起源于-年前）。有人认为，由于较易发生“回复突变”，病毒变异不会累积，长期进化速度可能较慢。病毒可能在感染过程中或传播事件后迅速发生变化，而在很长一段时间内没有序列变化。病毒进化不同观察时期的比较表明，病毒进化率是持续下降的，在较长时间（数百万年）内，HBV的进化率接近宿主，这意味着病毒和宿主之间的长期共存关系导致它们相互适应。病毒被“诱捕”进宿主的概念也可以解释包括HBV在内的各种病毒限制性的组织趋向性、病理学和传播途径。尽管多种宿主-病毒因素导致了短期病毒变异，但长期变异鲜有发生，这种理论有助于解释有关HBV进化的困惑。
病毒多样性的临床表现
研究表明，HBV自然史和疾病进展中的一些变化可能不仅与特定的病毒变异相关，还与病毒准种的总体多样性相关。人类HBV目前分为9种已确认的HBV基因型（A–I）和1个假定的基因型（J）；这些基因型又可进一步细分为许多具有特定地理分布的亚基因型。人类HBV感染的自然史在不同基因型之间有很大的差异，主要体现在传播方式倾向性、HBeAg血清转化的时间、肝病进展的速度和严重程度以及HBsAg血清清除的可能性上。例如，B、C基因型通常在围产期传播，而A、D基因型通常在成年或儿童早期传播。C基因型被认为是HBV所有基因型中致癌性最强的，一项对不同基因型患者发生肝癌风险的荟萃分析发现，C基因型的HBV感染者中HCC发生率（30%）明显大于A型或D型HBV感染者（7%）。尽管HBV相关的HCC通常在老年人群中发生，但在A1或F基因型占优势的人群中，慢乙肝发展为肝癌的时间要早得多：A1型男性青少年中诊断肝癌的平均年龄比非A基因型青少年小6.5岁，F基因型年轻人诊断肝癌的中位年龄为19.9岁。同样，体外细胞实验结果表明，HBV不同基因型的病毒复制和蛋白质表达方面也有显著差异。
在治疗后应答上不同基因型之间也存在差异，这种差异在免疫调节疗法IFNα治疗中体现的尤为明显。在HBeAg和HBsAg血清清除率方面，感染A基因型HBV的患者对IFNα治疗的应答最好，而感染C、D基因型的患者应答率最低；相比之下，不同基因型HBV对核苷（酸）类似物治疗的应答并无明显差异。在不同基因型的治疗中，实现功能性治愈（HBsAg转阴）的可能性也存在差异。一项针对HBV免疫清除期患者的研究表明，HBsAg的转阴几乎仅限于感染A型和D型的白人患者，在感染B型和F型的亚洲患者中很少见，而在C基因型的所有感染者中均没有观察到功能性治愈。
HBV基因型也可能影响停止治疗后发生功能性治愈的可能性，年发表的一项针对HBeAg阴性患者的研究表明，C基因型是HBsAg转阴的独立预测因子。这一发现与先前的一项研究结果不同，那项研究称B、C基因型患者的HBsAg转阴情况没有差异，尽管这项研究包括HBeAg阴性和HBeAg阳性的患者。基因型与治疗期间或停止治疗后的临床结果之间的关系，需要在更大规模的队列中进一步研究。
临床相关HBV突变株及其对抗病毒治疗的影响
HBV特定基因的变异与其自然史的某些阶段有关。HBeAg蛋白的多样性会影响宿主与病毒之间的免疫调节平衡，BCP和PC区的突变可能就是由于宿主对HBeAg的免疫压力出现的，而且这些突变与HBeAg血清学转换有关。由于HBV基因组中存在开放阅读框（ORF）相互重叠的这一特性，很多突变株对疾病进展的影响很难确定。一个单一的突变可以导致一个以上的蛋白质或调节区域发生变化，例如AT/GABCP突变株被证明可以在减少HBeAg的表达量的同时导致HBx蛋白第和位氨基酸的改变，这也可能引起表型变化。事实上，BCP突变体的出现也可能源于宿主免疫应答对HBx抗原表达的选择压力，尽管这一点尚待研究。
HBsAgORF中的sGR突变是最常检测到的疫苗逃逸突变，sPT/A和sDA等其他逃逸变异体也有报道。但截至目前，尚未见到疫苗逃逸突变株降低乙肝疫苗接种有效性的确凿证据。
HBV剪接变异、BCP突变或缺失（与和氨基酸重叠阅读框中的HBx突变相对应），以及在PC-core区（并非所有研究）或pre-S区存在突变或缺失与HCC进展或复发相关，但具体机制尚未确定。最新的体外和动物模型试验结果已经提供了一些线索，如HBx蛋白可影响与细胞增殖、凋亡和miRNA表达相关的多种信号通路，可能是HCC进展的辅助因子。同样地，HBx突变株也可能继承这一效应，如HBxF30V突变就与HCC增加相关。此外，还有一些影响HBsAg的产生或分泌的变异可能导致OBI表型。
尽管现有抗病毒疗法在控制HBV复制方面已经非常成功，但如果长期使用如拉米夫定这种低耐药屏障的药物，将有助于耐药突变株建立优势。目前，HBV基础研究领域和制药行业正积极探索和开发新的治疗方法，但HBV序列较高的变异性促进了耐药突变株的形成，这给新型抗病毒药物的研发带来了严峻的挑战。因此在开发过程中设计新分子时，应考虑序列变异和抗性突变体选择的可能影响。
HBV多样性的机制
新型HBV变异株的产生
HBV变异是由病毒复制周期中多种宿主-病毒相互作用下产生的（图3）。细胞因素包括宿主APOBEC酶对病毒DNA基因组的脱氨基作用、细胞RNA聚合酶在pgRNA转录过程中的错误插入和宿主DNA修复机制等；病毒因素包括易出错的病毒聚合酶、双链线性DNA产生、剪接体变异和病毒重组等。
图3HBV多样性的促进和限制机制
在HBV感染的炎症前期或暴露于外源性干扰素时，宿主APOBEC蛋白在肝细胞中表达上调。APOBECs最初被认为可直接影响cccDNA，但后续研究表明，HBV复制中间体可能是其脱氨基的主要靶点，编辑位置可能是HBV负链DNA的单链区。在这两种情况下，APOBECs（尤其是APOBEC3A、APOBEC3B和APOBEC3G）可能驱动了HBV病毒基因组序列多样性的增加。
细胞RNA聚合酶II参与病毒RNA（包括HBV-pgRNA）的转录，错误率约为1/(10?-10?)bp（即每10-个HBV就有一个SNP）。此外，在逆转录（负链DNA合成）和正链DNA合成过程中，HBV聚合酶也可产生SNP，估计比率分别为1/(10?-10?)bp和1/(3.6-15×10?)bp。因此，结合宿主因素和病毒复制机制可知，平均每一个新的HBV基因组产生，就可能会引入1-3个SNP。DNA损伤和宿主DNA修复过程可导致插入/缺失突变和HBV重组。双链DNA断裂的非同源修复是一个容易出错的过程，此时容易发生插入/缺失突变。pre-S1,pre-S2和核心区的缺失很常见，在HBV感染晚期尤其如此。
HBVDNA的存在形式具有多样性，例如，dslDNA和剪接变异体。尽管含dslDNA的病毒颗粒占比随着肝脏疾病的进展而增加，其含量仍只占总病毒颗粒的小部分（在大多数HBeAg阳性患者中约占5%）。HBVpgRNA转录后可形成剪接变异体，虽然该过程似乎并非HBV复制周期所必需的，但目前在患者血清中已至少鉴定出21种不同的剪接变异体。由于剪接过程中可能发生移码，其中一些剪接变异体可编码新的融合蛋白，这些融合蛋白也可能与致癌相关。
此外，病毒株间和基因型间也可以通过宿主DNA修复机制发生重组。HBV基因型间的重组是常见的。据推测，重组也发生在同一基因型的病毒准种之间，但这一点并不容易证明。对个假定重组基因组的荟萃分析证实重组位点在ORFs末端富集（尤其是HBsAg和HBcAg），这些可能反映了在选择压力下存活下来的毒株，而不是重组过程的固有特征。对古代HBV株中潜在重组事件的描述表明了重组在HBV进化中的重要性。在现代HBV序列中，某些重组体已经进化为不同的基因型（例如，I基因型和J基因型），而另一些则被归类为不同的亚基因型（例如，B2-5亚型，在整个亚洲中都有发现；C4基因型，只在澳大利亚土著人中发现；以及一些在西藏流传的C/D重组体）。
HBV变异株的选择压力
由于病毒复制能力、对抗病毒治疗的易感性或宿主免疫反应、病毒传播性以及由变异引起的疾病的严重程度等选择压力，新形成的变异大多数不太可能建立新的感染。
宿主抗病毒免疫反应形成选择性压力。例如，许多感染HBV的肝细胞在HBeAg血清转化后被免疫反应清除，病毒的进化也同时加速。PC区的nt的密码子突变因提前终止翻译而不能表达HBeAg，该突变可能使病毒逃避宿主对HBeAg的免疫反应，并在一段时间之后可能最终形成占优势的病毒群。由于pre-S1含有使HBV进入细胞的基序，pre-S1突变体不太可能导致感染。虽然这些变异可能在HBV的传播中没有作用，但它们可能会诱发HBV相关其他疾病。最后，由于相关的致死性急症限制了对后续宿主的传播，导致急性致命性病理学（如暴发性肝炎）的HBV突变体不太可能在更广泛的宿主人群中成为优势株。事实上也的确如此，尽管与野生型病毒株相比具有更高的复制率，但与暴发性疾病相关的HBV突变体并不会广泛传播。
HBV多样性的建立
为了在宿主（以及随后在更广泛的宿主群体中）成功建立一个HBV突变株，它必须在肝内cccDNA中占相当大的比例。因此，肝内HBVcccDNA的多样性可能比感染患者血液中循环的准种具有更重要的生物学意义。循环中的HBVDNA与肝内cccDNA的差异是一个微妙但关键的信息。大多数产生新变异的机制在初次感染后作用于cccDNA的下游（图3）。然而，大多数病毒颗粒（包括新产生的变种）不会引起感染，因此循环中的HBVDNA群体可能包含许多一过性准种，而这些准种在肝脏中并不以cccDNA的形式存在。鉴于循环HBV准种是大多数病毒多样性研究的目标，这种方法高估了肝内cccDNA的多样性。然而cccDNA多样性的检测在技术上是困难的，因此cccDNA在肝脏中的真实多样性仍然未知，这也是HBV生物学中的一个关键问题。
在静止的肝细胞群中，病毒的复制空间是有限的
对HBV病毒学的研究使我们了解到HBV是如何在肝脏中维持的，这提供了在肝细胞群中建立新变异株的可能机制。建立新变异株最重要的因素之一是复制空间。复制空间是由特定病毒体建立cccDNA的能力来定义的。有两个主要的假设途径形成新的cccDNA，被称为内源（NTCP非依赖性）和外源（NTCP依赖性）扩增途径，这两种途径在慢性HBV感染期间仅限于静息肝细胞群。简言之，新的HBV变异株的复制空间是其建立感染的限制因素。
在肝细胞更新时，病毒的复制空间中被释放出来。考虑到剩余肝脏中有限的复制空间，问题仍然存在：新的变异（例如抗病毒治疗耐药突变体）如何取代野生型病毒？因为必须释放复制空间，以便突变体在肝脏中建立，所以很可能cccDNA的替换发生在肝细胞更新过程中。由于HBVcccDNA在感染肝细胞有丝分裂过程中丢失，因此未受感染的子代肝细胞可作为新的HBV变体的宿主，并在整个肝细胞群中传播。在肝脏更新过程中，循环中的HBV突变株可能会感染新的肝细胞群，使病毒群不断进化，直到适合新微环境的突变株占优势。
HDV对HBV进化的影响
对HBV多样性的深入讨论也需要考虑到它与其卫星病毒HDV之间的相互作用。HDV完全依赖于HBV包膜蛋白来完成其生命周期和产生感染性HDV颗粒。HDV感染可以是HDV和HBV同时感染，也可以是已存在CHB感染的人群中传播HDV的重叠感染。HBV与HDV共感染患者与HBV单感染患者的比较研究表明，HBV和HDV合并感染患者的HBsAg保守位置百分比明显高于HBV单感染患者，提示HDV可以抑制HBsAg的遗传进化。HDV和HBV多样性对合并感染患者临床结局的影响尚需进一步研究。
总结
HBV的进化选择在多个层次上起作用：在人群水平、在宿主内和在病毒复制过程中。嗜肝病毒有着古老的祖先，随着多种新宿主物种中类嗜肝病毒的发现，嗜肝病毒分类系统正在迅速扩展。尽管跨物种传播的证据似乎很少，但仍有必要进一步研究。
在宿主内部，多种宿主和病毒因子驱动了HBV的多样性。然而，患者循环病毒群的多样性可能高估了HBVcccDNA的多样性。在静息肝细胞群中，cccDNA的变异在某种程度上是稳定的（尽管在循环中观察到了多样性），但是随着肝脏对免疫介导的细胞死亡的反应，cccDNA的变异会增加。然而，cccDNA多样性的测定在技术上是困难的，这也是HBV研究中的一个关键问题。
基因型的多样性在乙肝治疗史上表现出了相关性。随着针对HBV治疗的新的抗病毒治疗方法的发展，必须考虑到HBV的高度多样性，来确保以最小的耐药可能性开发泛基因型抗病毒治疗方法。此外，还需要进一步的研究来确定病毒多样性的增加是否与晚期肝病和肝癌的发展有关。
总之，对HBV和更广泛的HBV进化史的认识正在迅速加深，新的体外细胞培养感染模型正在使我们能够更详细地研究病毒变异的临床相关性。开发合适的体内模型，在更接近慢性HBV感染的条件下进行这些研究也很重要。独特的HBV复制策略赋予其进化上的优势，如快速获得抗病毒药物耐药性的能力，这是开发新的治疗方案必须考虑的。因此，为了最终开发出一个泛基因型治疗策略，关于HBV多样性的基础机制仍需进一步研究。
文献来源：
RevillPA,TuT,NetterHJ,YuenLKW,LocarniniSA,LittlejohnM.TheevolutionandclinicalimpactofhepatitisBvirusgenomediversity[publishedonlineaheadofprint,May28].NatRevGastroenterolHepatol.;10./s---6.doi:10./s---6
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